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顯色基質(zhì)法檢測(cè)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量

彭燕 張玲莉 王宗春（武漢大學(xué)人民醫(yī)院)

[摘要]

目的：建立快速的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法。

方法：使用顯色基質(zhì)鱟試劑對(duì)不同批號(hào)的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液分別進(jìn)行干擾試驗(yàn)考察確立乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液內(nèi)毒素定量檢查法。

結(jié)果：表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r≥0.98,乳酸左氧氟沙星在2mg.ml-1濃度無(wú)干擾作用。

結(jié)論：顯色基質(zhì)法與凝股法比較，有靈敏、快速、能定量、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于乳酸左氧氟沙星內(nèi)毒素含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 顯色基質(zhì)鱟試劑法；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾實(shí)驗(yàn)；熱原；乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法主要用于檢測(cè)注射用藥品中可能出現(xiàn)的內(nèi)毒素污染，以此控制藥品中熱原的含量。近年來(lái)很多分析檢驗(yàn)工作者進(jìn)行相關(guān)藥物的研究探討消除細(xì)菌內(nèi)毒素干擾辦法。本文對(duì)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)進(jìn)行了相應(yīng)的研究，建立了顯色基質(zhì)法檢測(cè)該藥的細(xì)菌內(nèi)毒素能更快速準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素質(zhì)量控制。

1.材料與試劑

1.1顯色基質(zhì)鱟試劑盒

鱟試劑（批號(hào)：120402）1.7ml ；顯色基質(zhì)（批號(hào)：120403）1.7ml；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）（批號(hào)：120401）10EU；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水（BET）（批號(hào)：120418）50ml；偶氮化試劑1（批號(hào)120326）10ml；偶氮化試劑2（批號(hào)120327）10ml；偶氮化試劑3（批號(hào)120328）10ml；HCL反應(yīng)終止劑（批號(hào)120329）50ml。以上產(chǎn)品全部為廈門鱟試劑廠生產(chǎn)。

1.2樣品

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液，規(guī)格：100ml含乳酸左氧氟沙星0.2g與氯化鈉0.9g）

1.3儀器和材料

除熱原玻璃反應(yīng)試管（10mm*75mm試管）、除熱原吸頭、除熱原空安瓿（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）試管架，盛冰水托盤，計(jì)時(shí)器，渦旋混合儀，精密恒溫水浴鍋，紫外可見分光光度計(jì)，玻璃比色皿，定量可調(diào)移液器。

2.方法與結(jié)果

2.1 供試品內(nèi)毒素限值的確定

細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M，式中K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑為5EU.kg-1.h-1；M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，按照乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液說(shuō)明書用法用量，成人一次0.4~0.6g靜脈滴注維持，約60min滴完，按靜注最大劑量600mg納入計(jì)算，1h接受的最大劑量為600mg（人均體質(zhì)量按60kg計(jì)算），則1h的M=10mg.kg-1.h-1。因此，本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=0.5EU.mg-1、由于本品的濃度為2mg.ml-1即L=1EU.ml-1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

取CSE1支，加入1ml BET水復(fù)溶，放置旋渦混合器上旋渦混合15min，得到10EU.ml-1溶液，然后用BET水將其稀釋至1EU.ml-1溶液，再分別取2ml反應(yīng)試管15支 ，分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素母液1EU.ml-1（0.8，0.6，0.4,0.2,0.0ml）和細(xì)菌 內(nèi)毒素檢查用水（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml） 制成不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.8，0.6，0.4, 0.2, 0.0EU.ml-1），每個(gè)濃度平行配制三管，每步稀釋內(nèi)毒素過(guò)程均需震蕩30s。各取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1ml分別加到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)試管中（冰浴），震蕩10s。然后置于37℃水浴箱中10min，取出置冰浴中，加入顯色基質(zhì)0.1ml，再置入37℃水浴箱中6min，取出置冰浴中，依次加入偶氮試劑一，偶氮試劑二，偶氮試劑三各0.5ml。震蕩5s后靜置5min，在紫外可見分光光度計(jì)中檢測(cè)545nm處吸光度（A），減去空白對(duì)照管平均A值。以Δ平均A值對(duì)內(nèi)毒素濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.7545X+0.0198，r=0.9970,r≥0.980表明實(shí)驗(yàn)有效。

2.3樣本的干擾實(shí)驗(yàn)

將批號(hào)為1130151、1121258、1130266的乳酸左氧氟沙星注射液樣品加入BET，稀釋為1:2,1:4,1:8,1:16倍數(shù)四個(gè)稀釋級(jí)（稱為NPC溶液），分別用四個(gè)不同稀釋級(jí)供試品溶液加入1EU.ml-1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為0.5EU.ml-1內(nèi)毒素溶液（稱為PPC溶液）;測(cè)量出PPC系列和NPC系列吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)毒素濃度，加入外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素（Cs），未加外源內(nèi)毒素的相同稀釋倍數(shù)供試品溶液內(nèi)毒素濃度（Ct），按公式計(jì)算該條例下的回收率R=（Cs-Ct）/0.5×100%，不同稀釋倍數(shù)樣品檢測(cè)A值及回收率，見表1。

結(jié)果顯示，1:2倍樣品稀釋溶液有一定干擾作用，1:4，1:8,1:16倍稀釋的供試品均無(wú)抑制作用，回收率在50%~100%之間。

2.4樣品的測(cè)定

選擇樣品稀釋1:4溶液作為供試品溶液檢查各批樣品內(nèi)毒素含量，試驗(yàn)過(guò)程不用加入細(xì)菌內(nèi)毒素原液其余加樣量同標(biāo)準(zhǔn)曲線制定。供試品內(nèi)毒素含量的測(cè)定，不同批號(hào)乳酸左氧氟沙星內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.討論

3.1顯色基質(zhì)法是繼家兔法，凝膠法后被納入《中國(guó)藥典》2005年版的法定內(nèi)毒素檢測(cè)法，此法是鱟試劑檢查法進(jìn)一步地發(fā)展和提高。由于其具有快速、靈敏度高、可定量、重復(fù)性好的特點(diǎn)。已被廣泛應(yīng)用于樣品內(nèi)毒素含量檢測(cè)。與凝膠法相比，樣品抗干擾能力加強(qiáng)，使用凝膠法測(cè)定左氧氟沙星注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量，有文獻(xiàn)[1,2]顯示，凝膠法測(cè)定乳酸左氧氟沙星注射液必須稀釋1:16或1:8以后才能排除干擾，進(jìn)行半定量檢測(cè)。而顯色基質(zhì)法抗干擾能力好，能夠定量測(cè)定樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，比凝膠法實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，科學(xué)。

3.2《中國(guó)藥典》規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒素含量定量方法主要有動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法和終點(diǎn)顯色基質(zhì)法，相比其他測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素含量，終點(diǎn)顯色基質(zhì)法采用混合物中細(xì)菌內(nèi)毒素濃度和其在孵育終點(diǎn)是釋放出成色團(tuán)的數(shù)量之間存在量化關(guān)系測(cè)定內(nèi)毒素的含量，方法通過(guò)檢驗(yàn)特定波長(zhǎng)中吸光度大小；來(lái)定量，具有更好的重復(fù)性和可操作性。實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單易行，僅需要可見分光光度計(jì)和玻璃比色皿，不需要特別的實(shí)驗(yàn)儀器，在實(shí)驗(yàn)條件比較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)廠家均可開展，其他的檢驗(yàn)方法通常需要酶標(biāo)儀或者特定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用設(shè)備，因此在實(shí)際工作中該方法具有更好的推廣應(yīng)用前景。

3.3顯色基質(zhì)法除了對(duì)試驗(yàn)用品和稀釋液要求無(wú)熱原外，對(duì)鱟試劑靈敏度，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)樣品的干擾試驗(yàn)也有明確的規(guī)定和要求[3,4]，其中樣品的干擾試驗(yàn)是保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。用供試品溶液配制內(nèi)毒素回收率在規(guī)定的范圍內(nèi)，試驗(yàn)方為有效[5]。目前，排除干擾通常采用樣品稀釋法和其他適宜的方法。通過(guò)試驗(yàn)證明，如果用乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液1:4稀釋液作內(nèi)毒素含量檢查，可以達(dá)到較好的回收率。本文提供了定量測(cè)定乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。

參考文獻(xiàn)（略）

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